高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
1、樣品準(zhǔn)備：樣品準(zhǔn)備對(duì)HPLC分析結(jié)果至關(guān)重要。確保樣品純凈，并根據(jù)所需分離目標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)奶崛?、凈化和濃縮方法。
2、色譜柱選擇：根據(jù)需要分離的化合物特性選擇合適的色譜柱。考慮分離機(jī)理、柱填料類型、柱尺寸和固定相親水/疏水性等因素。
3、流動(dòng)相選擇：根據(jù)待分離物的極性選擇合適的流動(dòng)相組合。優(yōu)化溶劑體系，平衡分辨率和保留時(shí)間。
4、校準(zhǔn)曲線：為了定量分析，建立準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線并進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制備一系列濃度點(diǎn)，并確定響應(yīng)因子或檢測(cè)靈敏度。
5、進(jìn)樣方法：選擇適當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣方法，如自動(dòng)進(jìn)樣器或手動(dòng)進(jìn)樣。確保進(jìn)樣量恒定且符合儀器要求。
6、溫度控制：一些分析可能需要在特定溫度下進(jìn)行。使用恒溫箱或列溫控制器確保色譜柱處于穩(wěn)定的溫度條件下。
7、檢測(cè)器設(shè)置：根據(jù)目標(biāo)化合物的特性選擇合適的檢測(cè)器。常見的檢測(cè)器包括紫外-可見光譜檢測(cè)器（UV-Vis）、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。
8、數(shù)據(jù)分析：正確解釋和分析HPLC數(shù)據(jù)是確保準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。使用合適的軟件進(jìn)行峰識(shí)別、積分和定量計(jì)算。
9、儀器維護(hù)：定期進(jìn)行儀器維護(hù)和校準(zhǔn)，包括清洗色譜柱、更換流動(dòng)相溶劑和檢查液壓系統(tǒng)等。
